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DNA提取試劑盒的使用方法
更新時間:2011-07-11 點擊次數:2837
DNA提取試劑盒的使用方法●操作方法操作流程見圖1,全套操作約需1小時,分勻漿、細胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟,詳細說明如下:1. 勻漿和細胞裂解。使用不同的實驗材料需采用不同的勻漿步驟,具體說明如下:【從動物組織中提取基因組DNA】◆使用研缽進行勻漿時:① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的研缽中,快速用力展研成勻漿。注)下列組織請加液氮研磨至粉末狀。A.富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。B.富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。C.富含角質蛋白的組織或堅硬的組織(如骨骼)等。② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1,溫和研磨30秒鐘。注)使用上述①-注)的實驗材料時,請在加入Solution A及RNase A1后,將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl,請補充Solution A至650 μl,65℃保溫5分鐘。◆使用研磨棒進行勻漿時:① 取1~100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的Collection Tube 中,用研磨棒快速研磨成糊狀。② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中,充分振蕩混合后,65℃保溫5分鐘。【從植物材料或植物培養細胞中提取基因組DNA】① 按下表稱取適量的新鮮植物材料(如選用的是冷凍干燥植物材料,則用量減半),剪成小塊放入研缽中,加入液氮,待樣品冷凍*后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應間斷加入液氮以防止材料融化。植物材料種類植物材料使用量*植物花、葉片10~100 mg植物莖60~240 mg植物根80~240 mg植物種子80~240 mg* 如選取植物的根、種子等樣品時,因其基因組DNA含量很低,需使用超過表格中所示的參數用量,此時請分兩管進行步驟1~6的實驗操作,在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾,使各管的基因組DNA結合到同一個Spin Column上。如從培養的植物細胞中提取基因組DNA,請離心收集2×103~1×107的培養植物細胞,加入150 μl水充分懸浮細胞后移入研缽中,加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。注)樣品研磨應充分,否則將會嚴重影響基因組DNA的收率。② 將研缽移至65℃水浴,當樣品粉末剛開始融化時,向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1,用力碾磨30秒。③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中。如勻漿體積不足650 μl,請補充Solution A至650 μl。65℃保溫15分鐘。注)處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質的種子等時,可延長水浴時間至60分鐘。【從全血中提取基因組DNA】① 取10~250 μl的全血(含抗凝劑)加入至Collection Tube中。② 加入500 μl的Solution A。③ 加入1 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘后,冰浴5分鐘。注) 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl;禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl。【從培養細胞中提取基因組DNA】◆使用懸浮培養的動物細胞時:① 使用Collection Tube收集1×105~1.5×107的細胞懸浮液,5,000 rpm離心5分鐘,棄上清(細胞培養液)。② 加入150 μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細胞。③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘,然后室溫靜置1分鐘。◆使用貼壁細胞時:① 棄盡培養液,向培養皿中加入650 μl的Solution A,室溫靜置1分鐘。注)96孔板等的每個孔中一次容納不了650 μl 溶液時,請分數次處理細胞。② 用移液槍的槍頭吹落貼壁培養細胞,取650 μl的細胞懸浮液轉移至Collection Tube中。③ 加入0.8 μl的RNase A1,激烈振蕩15秒鐘,然后室溫靜置1分鐘。2. 加入400 μl的Solution B,振蕩混合。3. 加入1 ml的4℃預冷的Solution C,充分混勻后,12,000 rpm離心2分鐘。4. 棄去上層有機相,再加入1 ml的4℃預冷的Solution C,充分混勻后,12,000 rpm離心2分鐘。5. 棄去上層有機相,然后將水相溶液(無色下層)轉移至置于Collection Tube上的Filter Cup中,12,000 rpm離心1分鐘。注)有機相(上層)帶有顏色,請務必除盡,否則會阻礙DNA結合到DNA制備膜上。相間沉淀不必考慮,在過濾時將被去除。6. 棄Filter Cup,在濾液中加入400 μl的DB Buffer,混合均勻。7. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。將上述操作6混合溶液轉移至Spin Column中,12,000 rpm離心1分鐘,棄濾液。8. 將500 μl的Rinse A加入至Spin Column中,12,000 rpm離心30秒鐘,棄濾液。9. 將700 μl的Rinse B加入至Spin Column中,12,000 rpm離心30秒鐘,棄濾液。注)請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B,這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。10. 重復操作步驟9。11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入50~200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。注)把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。如果實驗室備有適合于Spin Column接口的負壓裝置,可從上述操作步驟6完成以后進行以下操作。7. 將試劑盒中的Spin Column插到負壓裝置的插口上,將上述操作步驟6的混合溶液轉移到Spin Column中,開啟調節負壓裝置,緩慢吸走Spin Column中的溶液(流速控制在1滴/秒)。8. 將負壓調至zui大,向Spin Column中加入500 μl的Rinse A,吸盡Spin Column中溶液。9. 向Spin Column中加入700 μl的Rinse B,吸盡Spin Column中溶液。注)請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B,這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。10. 重復操作步驟9。然后從負壓裝置上取下Spin Column,將其安置于試劑盒中的Collection Tube上,12, 000 rpm離心1分鐘。11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入50~200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer,室溫靜置1分鐘。注)把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。 

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